您的位置:澳门尼斯人app > 生命科学 > 流式细胞术检测血小板功能及其临床应用

流式细胞术检测血小板功能及其临床应用

发布时间:2020-04-22 23:54编辑:生命科学浏览(119)

    图片 1

    来自荷兰莱顿大学的研究人员开发出一种表征斑块内肥大细胞的新技术; 动脉粥样硬化斑块发展的主要免疫介质。

    核心提示: 血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。然而,在血小板相关疾病

    研究人员使用一种新的流式细胞仪分析方法,设计出一种精确的方法,通过独特的表面蛋白鉴定这些斑块内肥大细胞的特定亚群,并确定其激活机制。对这些动脉粥样硬化介质的详细了解为开发人类动脉粥样硬化的新疗法提供了重要机会。

    图片 2

    血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。然而,在血小板相关疾病的诊断中,检测血小板功能的方法常常是有争议的。这通常是由于方法本身的原因造成的,譬如,静脉阻滞、抗凝剂选择、离心,甚至标本处理不当等因素,都可导致医源性血小板激活,影响临床诊断的价值。这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便,最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。

    发表在细胞杂志上的研究结果建立在之前的研究基础上,该研究已经确定了CD117+FcRI+斑块内肥大细胞亚型在斑块发育,进展和去稳定中的特定作用。然而,它们的表征以前依赖于免疫组织化学,其仅通过少数表面标记物表征细胞身份。

    研究人员使用一种新的流式细胞仪分析方法,设计出一种精确的方法,通过独特的表面蛋白鉴定这些斑块内肥大细胞的特定亚群,并确定其激活机制。对这些动脉粥样硬化介质的详细了解为开发人类动脉粥样硬化的新疗法提供了重要机会。

    由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断,近年来,文献报道利用流式细胞术,特别是全血法流式细胞术,检测血小板膜糖蛋白的表达。该技术能灵敏、特异地检测血液中活化血小板,并评价其功能。现就全血法流式细胞术检测血小板功能的方法及临床应用现状和潜力进行综述。

    反过来,这限制了科学家精确表征肥大细胞的能力,包括其激活状态的知识。现在,Kritikou等人开发了基于流式细胞仪的方法。,已经启用了基于多标记的特定肥大细胞类型的鉴定,以及它们在人动脉粥样硬化斑块中存在的激活状态。

    发表在“ 细胞 ”杂志上的研究结果建立在之前的研究基础上,该研究已经确定了CD117 + FcεRI +斑块内肥大细胞亚型在斑块发育,进展和去稳定中的特定作用。然而,它们的表征以前依赖于免疫组织化学,其仅通过少数表面标记物表征细胞身份。

    一、全血法流式细胞术

    用免疫组织化学和流式细胞仪检测

    反过来,这限制了科学家精确表征肥大细胞的能力,包括其激活状态的知识。现在,Kritikou 等人开发了基于流式细胞仪的方法。,已经启用了基于多标记的特定肥大细胞类型的鉴定,以及它们在人动脉粥样硬化斑块中存在的激活状态。

    1.方法学:流式细胞仪能快速测定大量个体细胞的特性。样品中欲分析的细胞预先进行荧光标记,然后由压缩氮经硅管送达标本室,再以5 000~10 000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。在适当波长的激发光作用下,被特殊染色的细胞发射出一定量的荧光脉冲讯号。探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射,然后传入计算机进行分析。

    Kritikou教授及其团队开发了一种新的流式细胞术方法,可以使用多种细胞标记准确确定肥大细胞的身份和活化状态。Kritikou和她的团队一起描述了它们在动脉粥样硬化中的病理作用的激活机制。

    用免疫组织化学和流式细胞仪检测

    传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达,常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。由于血小板极易活化激惹,样本经离心、洗涤等步骤,容易人为地导致体外血小板激活,影响临床诊断价值。为此,Shatti等引入了全血法流式细胞术。该技术能使用全血样本测定循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的功能应答。

    已知肥大细胞活化主要通过与其高亲和力受体FcRI结合的抗体IgE的复合物发生。这使它们对抗原结合敏感。响应于抗原,IgE-FcRI复合物的交联激活肥大细胞,最终释放免疫应答介质。

    Kritikou教授及其团队开发了一种新的流式细胞术方法,可以使用多种细胞标记准确确定肥大细胞的身份和活化状态。Kritikou和她的团队一起描述了它们在动脉粥样硬化中的病理作用的激活机制。

    全血流式细胞术样本制备步骤为:

    Kritikous的数据证实,这种经典模型提供了斑块内肥大细胞的主要激活机制。这些活化IgE片段的进一步表征揭示了它们在斑块组织中的位置,证实了循环IgE水平与灾难性心血管事件之间的相关性。他们的研究表明IgE是心血管事件发生的危险因素,并提供了对过敏和动脉粥样硬化如何联系的理解。

    已知肥大细胞活化主要通过与其高亲和力受体FcεRI结合的抗体IgE的复合物发生。这使它们对抗原结合敏感。响应于抗原,IgE-FcεRI复合物的交联激活肥大细胞,最终释放免疫应答介质。

    抽血抗凝→稀释→生物素化的检测用单克隆抗体→激动剂或缓冲液→固定→FITC标记的鉴别用单抗→PE-卵白素→稀释。

    Kritikou和她的团队分析了从患者的股动脉和颈动脉部位收集的22个动脉粥样硬化斑块样本。进行免疫组织化学染色以鉴定肥大细胞。随后用针对特征性表面标志物(CD45,CD117,FcRI,CD117和IgE)的荧光标记物以及在肥大细胞活化时释放的颗粒介质,类胰蛋白酶进行抗体染色,用于流式细胞术分析。为了确定它们的活化状态,研究人员筛选了共同存在的CD63,一种脱颗粒的介质和一种脱颗粒的敏化剂IgE。

    Kritikous的数据证实,这种经典模型提供了斑块内肥大细胞的主要激活机制。这些活化IgE片段的进一步表征揭示了它们在斑块组织中的位置,证实了循环IgE水平与灾难性心血管事件之间的相关性。他们的研究表明IgE是心血管事件发生的危险因素,并提供了对过敏和动脉粥样硬化如何联系的理解。

    稀释样本是为了防止血小板聚集,否则单个血小板上的抗原量就测不出来了,因为流式细胞仪测定的是单个粒子的荧光,而不管这单个粒子是一个血小板还是几个血小板的聚集体。当用凝血酶作外源激动剂时,为防止血小板聚集并形成纤维蛋白凝块,可在全血标本中加入四肽化合物Gly-Pro-Arg-Pro 。固定这一步若不干扰单抗的结合,生物素化的检测用单抗也可以在固定后加入。血小板鉴别用单抗可在针对血小板特异性膜糖蛋白GPⅠb,GPⅡb,GPⅢa的单抗中任选一种。标记这单抗的荧光试剂可在FITC、PE、PE-CY53种荧光染料中任选。

    流式细胞术的使用使得几种标记物能够用于鉴定负责促进患者的动脉粥样硬化进展的肥大细胞的特定亚群。进一步的激活筛查显示,来自两个位置的肥大细胞均为两种标记物IgE和CD63阳性,表明它们具有高度活化状态;人类动脉粥样硬化进展的已知标志物。

    Kritikou和她的团队分析了从患者的股动脉和颈动脉部位收集的22个动脉粥样硬化斑块样本。进行免疫组织化学染色以鉴定肥大细胞。随后用针对特征性表面标志物(CD45,CD117,FcεRI,CD117和IgE)的荧光标记物以及在肥大细胞活化时释放的颗粒介质,类胰蛋白酶进行抗体染色,用于流式细胞术分析。为了确定它们的活化状态,研究人员筛选了共同存在的CD63,一种脱颗粒的介质和一种脱颗粒的敏化剂IgE。

    样本随后用流式细胞仪检测。通过荧光极性和特异性光散射鉴别出血小板后,检测5 000~10 000个血小板表面的特异性荧光讯号。检测结果可用两种方法表示。一种是平均颗粒荧光强度,另一种是特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率。阳性血小板百分率法与荧光信号的放大倍数无关,且可以检测受损伤部位血小板亚群的变化。如果检测的是血小板表面某抗原的总量,则荧光强度法更为适合。譬如,在活化状态下,血小板表面GPIb-IX-V复合物含量比静息时低,但降低的幅度小,通常还不足以报告阴性结果,这时用荧光强度法就比阳性血小板百分率法更合适。

    在没有任何结合在表面的IgE片段的情况下,少部分斑块内肥大细胞被激活。这一发现使研究人员得出结论,CD117+FcRI+斑块内肥大细胞亚型激活的主要手段是通过IgE与FcRI的结合而发生的,而少量细胞是独立于IgE而激活的。正如Kritikou和研究人员所说,这些研究结果通过针对人类动脉粥样硬化中IgE介导的作用为潜在的治疗干预铺平了道路。,

    主要肥大细胞激活途径 - 发掘基于IgE的治疗靶点

    目前传统的流式细胞术还不能定量分析结合位点的绝对数目,但Shatti等利用125I和生物素双标记的单抗进行研究,以PE-卵白素作为荧光结合试剂,发现碘标测定的结合位点数与荧光强度间有线性关系。因此,对于一个特定的单抗,一旦弄清这一线性关系,并知道荧光单抗上荧光素与抗体的摩尔比,就能利用流式细胞仪定量分析该抗体结合位点的绝对数目。目前有一些商品试剂盒能定量测定结合到单个细胞上的抗体数目,但乏见用于血小板的报道。

    流式细胞术的使用使得几种标记物能够用于鉴定负责促进患者的动脉粥样硬化进展的肥大细胞的特定亚群。进一步的激活筛查显示,来自两个位置的肥大细胞均为两种标记物IgE和CD63阳性,表明它们具有高度活化状态; 人类动脉粥样硬化进展的已知标志物。

    2.优缺点:与常规血小板功能测定法比,全血法流式细胞术有许多优点。

    在没有任何结合在表面的IgE片段的情况下,少部分斑块内肥大细胞被激活。这一发现使研究人员得出结论,CD117

    首先,标本处理的简化能避免血小板体外医源性激活,并防止血小板亚群丢失;循环中的红细胞、白细胞对血小板的活化有影响,因此本法能在最接近受检者体内环境的条件下测定血小板功能。同时,由于使用了血小板鉴别用单抗,检测的仅是血小板,而不会受其它种类细胞或碎片的干扰,保证了检测的特异性。其次,在血栓性疾病中,通常只有小部分的血小板被活化;凝血酶体外活化血小板,也常表现为亚群激活;活化血小板表达CD62等膜糖蛋白也有明显的异质性。本法能灵敏地检测出少到1%的活化血小板亚群,尤其是能分析单个或亚群血小板膜上活化标志物的变化,使检测结果更接近真实。若同时使用FITC、PE、PE-CY5 3种荧光染料,本法通过三色标志一次能同时检测两个抗原标志物的变化。

    • FcεRI +斑块内肥大细胞亚型激活的主要手段是通过IgE与FcεRI的结合而发生的,而少量细胞是独立于IgE而激活的。正如Kritikou和研究人员所说,这些研究结果通过针对人类动脉粥样硬化中IgE介导的作用为潜在的治疗干预铺平了道路。”,

    此外,做一次检测仅需2 μl血液,这一点,尤其适合于新生儿和血小板减少性疾病患者。本法不使用同位素,没有放射性污染。 全血法流式细胞术也存在不足之处。譬如,流式细胞仪价格高昂,检测费用高,仪器操作复杂。为了避免体外活化,血样需在45分钟内处理,不能久置。另外,流式细胞仪仅检测循环中的血小板功能,而β-TG、PF4和TXA2的检测还能反映血管壁上血小板的活化和新近被清除的血小板。虽然存在着这些不足,但本法仍是血小板功能检测的突破性进展。

    希望进一步研究肥大细胞功能,揭示新的激活途径,这将为开发抗动脉粥样硬化进展的新疗法提供机会。#清风计划#

    二、全血中活化血小板的检测

    1.血小板特异性膜糖蛋白:本法检测血小板功能,首先要对全血中的血小板进行特异性荧光标记,将血小板与血样中其他血细胞区分开来。针对血小板表面特异性膜糖蛋白制备的单抗,使血小板特异性标记成为可能。血小板膜糖蛋白已被深入研究,表1显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在这些膜糖蛋白中,仅在血小板膜表面表达主要有GPⅠb,GPⅡb,GPⅢa等有限的几种。根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗,能在全血中特异性地识别血小板,仅给血小板做上荧光标记。

    表1 血小板膜上主要的糖蛋白及其功能

    膜糖蛋白 基因家族 配基 功能
    GPⅠa/Ⅱa 整合素 胶原 粘附
    GPⅠc/Ⅱa 整合素 Fn 粘附
    GPⅠc/Ⅱa 整合素 Laminin 粘附
    GPⅡb/Ⅲa 整合素 Fb,vWF,Vn,Fn 聚集
    Vn受体 整合素 Vn,?vWF,?Fn 粘附
    GPⅠb/Ⅸ LRG vWF,凝血酶 粘附
    GPV LRG ? 凝血酶底物
    GPIV Thrombospodin 粘附
    GP53 血小板-粒细胞
    GMP140 选择素 相互作用

    注:vWF血管性假血友病因子;Fb纤维蛋白原;Fn纤维粘连蛋白;Vn体外粘连蛋;LRG富含亮氨酸家族

    2.活化血小板的标志物:活化血小板与静息血小板相比,其质膜糖蛋白常发生显著的变化,这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物。 全血法流式细胞术也是一种免疫学方法,活化血小板表面能通过免疫方法检测的标志物可分为三类:第一类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时,其颗粒膜与质膜发生融合,颗粒膜蛋白,如CD62、CD63,在质膜上表达,成为活化血小板的分子标志。第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa的PAC1表位,它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。因此,使用这个表位的荧光单抗,我们能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。另外,GPIV 虽然在静息血小板上也表达,但活化血小板上表达量更高;GPIb-IX-V复合物则相反,与静息血小板相比,活化血小板上表达量显著降低。它们都是活化血小板的分子标志。第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原,包括纤维蛋白原,Xa因子和thrombospondin等。这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。 除检测免疫性的分子标志物外,流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。如用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca2+流,用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平来检测活化血小板的释放功能等。

    3.单抗的选择:与血小板有关的CD单抗有CD9,CD31,CD36,CD41a-b,CD42a-d,CD61,CD62,CD63 ,CD107a-b等。活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD单抗。表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。

    本文由澳门尼斯人app发布于生命科学,转载请注明出处:流式细胞术检测血小板功能及其临床应用

    关键词:

上一篇:让沙漠绽放生命之花

下一篇:没有了